Storia del microscopio ottico

La storia del microscopio ottico è alquanto complessa per quanto riguarda le sue origini. Infatti fin da tempi molto antichi era conosciuta l’arte di tagliare pietre dure in forme sferiche, concave e convesse, tali da poter permettere un’osservazione leggermente ingrandita degli oggetti. Tuttavia non si può prendere questo periodo come punto di inizio nella storia di questo strumento, almeno nella versione come noi oggi lo conosciamo. Bisogna andare molto avanti negli anni per arrivare ad una concezione veramente scientifica sulla sua formazione e sul suo impiego.

Infatti, in Italia il precursore è considerato il Rucellai, che nel suo poemetto “Le Alpi”, scritto verso il 1523-1524, ci dà una descrizione delle osservazioni fatte con l’ausilio di una lente su membrane sezionate di api. Ma soltanto all’inizio del secolo XVII si ha una vera e propria spinta nel campo dell’ottica con la creazione del cannocchiale e quindi dei primi strumenti di ingrandimento.

In Italia l’invenzione del microscopio ottico è attribuita a Galilei e note sono infatti le prime osservazioni compiute da Stelluti e da altri con l’apparecchio costruito dal Galilei. Il progresso è in questo secolo effettivamente notevole e l’Italia vi partecipa con parecchi studiosi, alcuni dei quali, come il Bonanni, danno già delle descrizioni particolareggiate sulla tecnica microscopica.

Di mano in mano che procedevano le altre scienze anche il microscopio ottico subiva modificazioni e perfezionamenti. Si studiarono e si risolsero infatti le aberrazioni cromatiche, le aberrazioni geometriche, ecc…Tutte queste ricerche portarono a perfezionamenti sempre più sensibili nella costruzione, tanto che oggi si hanno a disposizione apparecchi dalle prestazioni mirabili da ogni punto di vista.

Parti che compongono i microscopi ottici

Il microscopi ottici sono costituiti dalle seguenti parti: un sistema ottico, un sistema di illuminazione dal preparato, una struttura portante (chiamato anche stativo).

Sistema ottico

Il sistema ottico è formato da un oculare e un obiettivo, entrambi eventualmente intercambiabili, montati agli estremi di un tubo, dal quale possono facilmente essere estratti. Il sistema ottico è tale che può fornire un’immagine del preparato solo se la distanza fra oculare e obiettivo è fissata ad un ben determinato valore; tale distanza viene detta lunghezza meccanica del tubo ed è usualmente assunta pari a 16 cm dalle case costruttrici italiane e tedesche e 24 cm dalle case inglesi.

Il tubo, onde evitare eccessivi ingombri, è realizzato in due parti, che scorrono telescopicamente l’una entro l’altra e vengono messe a punto solo al momento dell’uso dell’apparecchio. L’oculare spesso è dotato di micrometro.

L’obiettivo è sempre fortemente convergente, corretto al massimo limite contro le aberrazioni cromatiche, di sfericità, ecc…A parte le diversità date dal numero e tipo di lenti componenti, gli obiettivi per microscopi vanno divisi in obiettivi a secco e obiettivi a immersione.

I primi permettono l’osservazione diretta del preparato, i secondi richiedono che lo spazio tra essi e il preparato da osservare sia riempito con un liquido opportuno (la distanza obiettivo-oggetto è di qualche decimo di mm, quindi occorrono una o due gocce di liquido) e consentono di ottenere ingrandimenti superiori.

E’ evidente che, cambiando obiettivo (o oculare o entrambi), si possono cambiare le caratteristiche del sistema obiettivo-oculare e quindi l’ingrandimento che questo può dare. In molti microscopi esiste una torretta girevole, nella quale sono allogati tre o più obiettivi; girando la torretta (detta anche trousse) gli obiettivi vanno automaticamente a porsi in sede all’estremità inferiore del tubo.

La messa a fuoco dell’immagine del preparato si ottiene variando la distanza obiettivo-preparato; a tale scopo il tubo può compiere degli spostamenti verticali, comandati a mezzo di una vite di piccolo passo (nei buoni microscopi le viti sono due: la prima per spostamenti rapidi e piuttosto sensibili, la seconda per spostamenti micrometrici di aggiustaggio).

Sistema di illuminazione

Il sistema di illuminazione del preparato dipende essenzialmente dal preparato stesso, cioè se esso è trasparente o no. Nel primo caso il preparato, posto tra due vetrini (porta-oggetto e copri oggetto), estremamente sottile e traslucido, viene illuminato facendolo attraversare da un fascio di luce proveniente dal basso.

Tale luce può essere quella d’ambiente, raccolta e deviata verso l’alto da uno specchietto, oppure può derivare da un’opportuna sorgente artificiale; quale che ne sia l’origine, il flusso luminoso viene convogliato e concentrato sul preparato tramite un condensatore. Il sistema ottico costituente il condensatore è dotato di un diaframma ad iride, che regola il fascio di raggi luminosi in modo che questi, una volta attraversato il preparato, entrino tutti nell’obiettivo, evitando dispersioni; prima del condensatore possono essere inseriti dei filtri colorati o polarizzatori per osservazioni speciali.

Tale tipo di illuminazione, detto per trasparenza o a campo chiaro, può causare abbagliamento dell’osservatore ed è questo il suo principale difetto. Sempre con preparativi trasparenti si può adottare l’illuminazione a campo oscuro, che ha il vantaggio di evitare l’abbagliamento dell’osservatore. Tale sistema è una modifica del precedente e consiste nell’inviare il flusso luminoso sul preparato secondo una direzione tale che i raggi di luce non possano penetrare nell’obiettivo; in queste condizioni l’osservatore capta solo la luce diffusa dal preparato.

Per ottenere il campo oscuro è necessario impiegare dei condensatori di tipo speciali. Ancora per i preparati trasparenti si può adottare la tecnica dell’osservazione in contrasto di fase. Si tratta di uno specialissimo sistema, che permette di trasformare quelli che in realtà sono dei piccoli contrasti di fase fra le varie onde luminose uscenti dall’oggetto in contrasti di brillanza, con eliminazione dello sfondo luminoso.

Nel caso dei preparati non trasparenti la sola illuminazione possibile è quella per riflessione; per questo caso sono stati fondamentalmente realizzati due sistemi: illuminazione con sorgente laterale (il più ovvio e semplice) oppure flusso luminoso frontale proveniente dalla stessa parte in cui è posto l’obiettivo.

Stativo

Infine, un’altra componente è lo stativo, la struttura portante che comprende la base di appoggio vera e propria, il porta condensatore, il tavolino portaoggetti e il meccanismo di comando degli spostamenti del tubo. La base non richiede cenni particolari: essa deve essere ben robusta, assicurare piena stabilità all’apparecchio ed assenza di vibrazioni.

Il porta condensatore è un accoppiamento di ghiera, nella quale è posto il sistema ottico, e cremagliera; girando la ghiera, si sposta in alto o in basso il condensatore, variando l’illuminazione del preparato.

Il tavolino portaoggetti, o piatto, serve a sostenere il preparato durante la sua osservazione; di solito esso è costituito da un disco, forato al centro per il passaggio della luce, dotato di movimenti micrometrici in ogni direzione, onde permettere di spostare l’oggetto in osservazione rispetto all’asse dell’obiettivo.

Modelli e tipi di microscopio

Esistono diversi tipi e versioni di questo importante strumento di ingrndimento, e una prima distinzione di base è quella tra semplici e composti.

Microscopio semplice

Consta di una lente oppure di una serie di lenti convergenti, tali da dare, di un oggetto posto fra la lente ed il suo fuoco, un’immagine virtuale, dritta, ingrandita. Nel caso del microscopio ottico semplice l’ingrandimento è dato dal rapporto tra la tangente trigonometrica dell’angolo sotto il quale l’immagine appare all’osservatore e la tangente dell’angolo sotto il quale apparirebbe l’oggetto, posto a 25 cm. dall’occhio senza interposizione della lente.

Questo tipo di ingrandimento prende il nome di ingrandimento convenzionale. L’osservazione però con una sola lente è sempre disturbata da fenomeni vari, quali colorazioni, offuscamento dell’immagine, ecc…Questi, per una buona osservazione, devono essere totalmente eliminati; si riesce a ciò con un opportuno sistema di lenti.

Microscopio composto

E’ di gran lunga più importante rispetto al “semplice”. La parte basilare di questo apparecchio è costituita dall’obiettivo che dà dell’oggetto osservato un’immagine reale ingrandita e capovolta, la quale viene osservata mediante l’oculare che agisce da microscopio ottico semplice.

L’oggetto è posto poco oltre il fuoco. In questo strumento l’ingrandimento è dato dal rapporto fra il prodotto della distanza del punto prossimo dall’occhio (25 cm.) e la lunghezza ottica del tubo (ossia la distanza tra i fuochi più vicini dell’obiettivo e dell’oculare), e il prodotto delle distanze focali rispettive di questi due. La teoria dei microscopi è basata sulle leggi dell’ottica, quali la riflessione e la rifrazione.

E’ appunto in base a queste due leggi che si sono potute apportare quelle modifiche alle lenti ed alla loro disposizione che hanno permesso di eliminare tutti gli inconvenienti dovuti ad aberrazioni cromatiche e geometriche. Il tipo “composto” ha raggiunto ora un elevato grado di perfezione ed è elemento di importanza fondamentale nelle moderne ricerche sia scientifiche sia tecniche.

Microscopio ultravioletto

Viene utilizzato in particolare nella ricerca in campo medico, che utilizza come sorgente luminosa una sorgente di radiazioni ultraviolette; e poiché il vetro è opaco a queste radiazioni, il suo sistema otticoè costituito da quarzo.

Essendo poi le emanazioni ultraviolette invisibili, l’occhio è stato sostituito da speciali emulsioni fotografiche o da schermi fluorescenti costituti da sostanze che, illuminate con raggi ultravioletti, emettono delle radiazioni fluorescenti visibili (chiamati microscopi a fluorescenza).

Si tratta di un comune microscopio ottico assai luminoso, nel quale il preparato viene illuminato da una lampada di quarzo a vapori di mercurio, schermata per mezzo di un filtro detto di Wood e costituito da vetro al nichel.

La maggior parte dei moderni microscopi è dotata della possibilità di inserire sul cammino dei raggi luminosi un dispositivo polarizzatore ed un analizzatore: la possibilità di esaminare i preparati in luce polarizzata permette di ottenere osservazioni assai importanti sulla struttura molecolare delle sostanze anisotrope e birifrangenti. Con tale mezzo si sono potute ottenere utili osservazioni in mineralogia sui complessi microcristallini.

Microscopio a contrasto di fase

La sua introduzione ha portato un notevole contributo alla ricerca scientifica specialmente nel campo biologico e batteriologico. Esso sfrutta un particolare sistema interferenziale che mette in evidenza le differenze di indice o di spessore dei singoli elementi di struttura del preparato, traducendoli in differenze di assorbimento simili a quelle che danno luogo alla formazione dell’immagine nel microscopio ottico comune.

In tal modo è resa molto agevole l’osservazione dei preparati “a fresco” che, anziché essere appena visibili e solamente nei loro contorni (versione normale), sono ricchi di particolari e di contrasto in tutta la loro estensione.

Microscopio elettronico

Rispetto a quello ottico, questo impiega fasci di elettroni al posto dei raggi di luce visibile. Infatti, come è noto, gli elettroni possono essere deviati a volontà mediante opportuni campi elettrostatici o magnetici, e d’altra parte il dualismo ondulatorio-crepuscolare, che si riscontra nella descrizione del microcosmo, consente di considerare i fasci di elettroni alternativamente come fasci di particelle viaggianti o come gruppi di onde propagantisi nello spazio, soggetti a leggi strettamente analoghe a quelle dell’ottica.

Anzi, la realizzazione dei microscopi elettronici costituisce al tempo stesso una brillantissima conferma della validità di quel dualismo ed una praticissima applicazione delle più moderne e a prima vista più astratte speculazioni teoriche. Si può dire in un certo senso che le stesse teorie moderne, che hanno stabilito l’invalicabilità dei limiti del microscopio ottico, hanno indicato la via per realizzare quello elettronico, che quei limiti ha permesso di superare.

Permette infatti di raggiungere ingrandimenti di gran lunga superiori a quelli raggiungibili con lo strumento ordinario, potendosi ottenere ingrandimenti dell’ordine di 100.000 volte. Il funzionamento del microscopio elettronico è del tutto analogo a quello dell’ordinario salvo che naturalmente in luogo di lenti ottiche si hanno lenti elettroniche costituite da bobine elettromagnetiche o da schermi elettrostatici forati.

Si è anzi sviluppata tutta un’ottica elettronica, sia nell’accezione di sistema di lenti elettroniche, sia nell’accezione di insieme di leggi della trasmissione, riflessione, rifrazione, dei fasci di elettroni accelerati, considerati come radiazione. Essenzialmente il microscopio elettronico è costituito da un filamento incandescente che funge da catodo, di diverse lenti elettroniche e di uno schermo fluorescente sul quale viene proiettata l’immagine.

Gli elettroni emessi dai filamenti debbono essere accelerati mediante potenziali dell’ordine di alcune decine dimigliaia di volt. Spesso lo schermo fluorescente viene sostituito con una lastra fotografica: si possono realizzare in tal modo microfotografie elettroniche, di grande utilità nella ricerca scientifica.

I microscopi elettronici, utilizzanti lenti elettrostatiche o magnetiche, hanno funzionamento strettamente analogo a quelli ottici. Ma la piccolezza degli effetti di diffrazione subiti dagli elettroni e le possibilità di deflettere un pennello di elettroni mediante un campo elettrico o magnetico, facendogli esplorare una certa superficie, fanno sì che con gli elettroni si possano ottenere immagini ingrandite degli oggetti utilizzando anche altri principi di funzionamento completamente diversi da quelli dei microscopi ottici.

• Microscopi elettronici trasmissione
  Sono stati così realizzati i microscopi elettronici trasmissione (TEM), a scansione (SEM), quelli a proiettore a punta, quelli a ombra e quelli ad emissione. Nello strumento elettronico a trasmissione gli elettroni che costituiscono il fascio attraversano il campione, facendo così in modo che ne derivi un’immagine ingrandita che viene visualizzata su una lastra fotografica.
• Microscopi elettronici a scansione
  Nei microscopi elettronici a scansione viene fornita un’immagine ingrandita della superficie di un oggetto. Rispetto a quello a trasmissione, che esamina zone estese, in questo a scansione si analizza la superficie del campione porzione per porzione. Un fascio di elettroni si muove lungo un campione, facendo in questo modo appunto da scansione. Gli atomi delle superficie che sono colpiti dagli elettroni del fascio, emettono “elettroni secondari”, i quali vengono raccolti per mezzo di un dispositivo elettronico. E’ stato anche realizzato il microscopio a scansione e a trasmissione (STEM) che mette insieme le caratteristiche di un SEM con quelle di un TEM e possiede un potere risolutivo molto elevato.
• Microscopi elettronici a proiettore a punta
  Nei microscopi elettronici a proiettore a punta, invece, un filamento incandescente ben appuntito posto nel vuoto dietro l’oggetto e tenuto ad un potenziale elettrostatico fortemente negativo rispetto ad uno schermo posto davanti all’oggetto, costituisce una sorgente praticamente puntiforme di elettroni che, propagandosi in linea retta, proiettano sullo schermo l’immagine ingrandita dell’oggetto: l’ingrandimento così ottenuto è semplicemente il rapporto tra le distanze punta-schermo e punta-oggetto. Il vantaggio costituito dall’enorme semplicità di questo microscopio è compensato dall’inconveniente dell’estrema sensibilità dell’emissione elettronica, da parte del catodo a punta, alla pressione residua dei gas nell’ampolla a vuoto, che esclude l’uso di giunti a tenuta smontabili, con evidente complicazione per la sostituzione del campione. L’incoveniente è superato nei microscopi elettronici a ombra, nei quali il catodo a filamento appuntito è sostituito da un sottilissimo pennello di elettroni, ottenuto come nello strumento a scansione. Infine, in quelliad emissione l’oggetto costituisce al tempo stesso anche la sorgente degli elettroni.

Microscopi bioculari e i microscopi binoculari

Altri tipi di microscopi sono i microscopi bioculari e i microscopi binoculari. Si tratta in pratica di microscopi nei quali vi è un doppio oculare (microscopi bioculari) oppure undoppio oculare ed un doppio obiettivo (microscopi binoculari). Lo scopo è, in entrambi i casi, di agevolare notevolmente la manipolazione del preparato (microscopi per preparazioni biologiche, per orologeria e meccaniche speciali di precisione, ecc…). Il limite di questi apparecchi è nell’ingrandimento modesto che offrono: circa cento volte.

Microscopi a sonda

Esistono anche i microscopi a sonda i quali sono formati da una punta metallica sensibile e sottilissima (appunto la sonda) che può avere diametro che si può confrontare con le dimensioni di un singolo atomo. Un tipo di microscopio a sonda è il quello a “effetto tunnel“, inventato nel 1981. Tra la sonda e la superficie da ispezionare viene applicata una leggera differenza di potenziale; gli elettroni attraversano, proprio per effetto tunnel, lo spazio tra la punta della sonda e l’oggetto, formando così una corrente di tunnelling la cui intensità aumenta al diminuire della distanza tra la punta e gli atomi dell’oggetto.

Uso del microscopio ottico

L’impulso dato dal microscopio ottico alle ricerche scientifiche, e di conseguenza ai perfezionamenti tecnici, ha fatto sorgere una particolare tecnica detta “microscopica”, ossia vari metodi di ricerca basati su accorgimenti tecnici diversi (colorazioni, preparazione degli elementi da osservare, illuminazione, ecc…). Anche l’apparecchiatura impiegata per queste ricerche ha dovuto essere particolarmente studiata in modo da mettere a disposizione del ricercatore mezzi sempre più perfezionati. Questi mezzi vanno dalle forbicine da disserzione, dai bisturi, ecc…, impiegati nella tecnica istologica, al microtomo, pure impiegato nei più disparati campi di indagine, dalla metallografia all’istologia.

Tale strumento ha subito continui perfezionamenti tanto che oggi se ne hanno a disposizione diversi tipi, dal più semplice, azionabile a mano (impiegato oggi quasi esclusivamente in botanica), al microtomo a slitta, più robusto e adatto al sezionamento dei preparati metallografici, a quelli più rapidi o rotativi. Con questi apparecchi si possono ottenere sezioni sottilissime che vanno da 1 a 15-20 millesimi di mm., con spessori ben riproducibili. Importante è poi nel campo microtecnico la fissazione delle immagini in moda da permetterne la conservazione ed una più calma osservazione.

Altra tecnica importante è quella della colorazione, necessaria per mettere in evidenza punti o parti che altrimenti potrebbero sfuggire. Questo metodo di indagine è applicato oggi in tutte le ricerche microscopiche e già se ne sono avuti ottimi risultati sia nel campo metallografico che in quello microchimico.

Altro campo nel quale la tecnica microscopica ha importanza veramente notevole è quello interessante lo studio dei microbi; queste ricerche hanno infatti portato un notevole contributo alla conoscenza di questi organismi inferiori e di riflesso al campo industriale. Il campo principale delle ricerche ed applicazioni microscopiche è però il campo biologico. La conoscenza degli organi e parti di organi sia nell’uomo sia negli esseri superiori ed inferiori ha ricevuto infatti grande impulso dalle ricerche microscopiche.

Per queste ricerche si possono impiegare microscopi semplici e microscopi mono e binoculari da disserzione. I primi sono impiegati per un primo esame del materiale, mentre i secondi, di cui si hanno numerosissimi tipi più o meno dotati di sistemi ottici a grande potere risolutivo e meccanici di precisione, perfetti, sono usati per ricerche e studi più accurati.

Altro campo particolarmente importante è quello delle ricerche microscopiche sui vegetali. Qui la tecnica non si differenzia molto da quella relativa alle ricerche nel campo animale; soltanto presenta particolari accorgimenti per quanto riguarda lo studio della membrana cellulare e dei prodotti di elaborazione della cellula. L’osservazione microscopica può essere eseguita sia su materiale vivo sia su materiale morto.

Nel primo caso ben si prestano gli organismi unicellulari (come i batteri). Invece, l’esame del materiale morto ha per scopo lo studio degli esseri pluricellulari vegetali ed animali. L’esame del materiale morto non è tuttavia il mezzo esclusivo per lo studio dei pluricellulari, si può anzi ricorrere all’esame microscopico in vivo di talune parti addirittura di vertebrati.

Ancora di grande ausilio è la ricerca microscopica nel campo petrografico, mediante il microscopio mineralogico, così chiamato perché opportunamente modificato per questo genere di ricerche. Dal punto di vista dell’apparato ottico questo tipo di strumento non differisce da quelli comunemente impiegati, è però munito di polarizzatori. L’importanza di queste ricerche sta nel fatto che si possono osservare cristalli minimi e studiarli, potendosene così ricavare dati sufficienti per l’interpretazione.

Un’ultima importante tecnica microscopica è quella della cosiddetta osservazione ultramicroscopica o osservazione della luce diffusa lateralmente da particelle in sospensione di dimensioni più piccole delle minime osservabili direttamente, illuminate da un fascio di luce perpendicolare all’asse del microscopio. Le particelle appaiono quindi come puntini luminosi in campo oscuro (con un aspetto analogo a quello delle stelle nel firmamento) e non se ne può distinguere la forma. L’ultramicroscopio consente però di distinguere la posizione, e quindi il movimento, delle particelle.

Quest’ultima tecnica ha avuto grandissima importanza storica, perché ha consentito tra l’altro al Brown di mettere in evidenza il moto incessante, caotico e disordinato (moti browniani) delle particelle colloidali submicroscopiche in sospensione, causato dagli urti con le molecole del fluido nelle quali tali particelle sono appunto sospese, e quest’osservazione ha costituito una delle più brillanti verifiche sperimentali della teoria cinetica della materia.

Approfondire il microscopio ottico su internet

• Il microscopio
  Il sito è utilizzato dagli studenti di scienze biologiche e naturali dell’università di Firenze